Hvordan å lage en kalibreringsstandard for en HPLC
Når det arbeides med høy ytelse væskekromatografi (HPLC), er god kalibrerings helt avgjørende for å sikre pålitelige resultater kvalitet. Riktig kalibrering av et HPLC-instrument begynner med fremstillingen av en egnet kalibreringsstandard. I de fleste tilfeller, kalibrering faktisk krever en serie av standarder med økende konsentrasjon for å fremstille det som er kjent som en kalibreringskurve. Dette er en inntegnet linje og forbundet ligning som beskriver forholdet mellom konsentrasjonen av det kjemiske blir testet for, og responsen til den HPLC-detektor.
Bruksanvisning
• Bestem den kjemiske som du ønsker å teste for bruk av HPLC (den "analytten"). For eksempel kan du ønsker å teste en rekke brus for fruktose innhold, og i så fall fruktose ville være analytten.
• Få tak i en mengde av analytten kjemisk av egnet renhet. Normalt renhet bør være over 99% og analytten bør kjøpes fra en pålitelig kjemiske forsyningsselskap. I tilfelle av fruktose, for eksempel, ville du kjøpe ren fruktose fra en kjemisk leverandør og ikke fra en matbutikk.
• Bestem maksimums- og minimums forventet konsentrasjoner av analytten i prøvene du har tenkt å teste på HPLC. I tilfelle av brus, ville du undersøke etikettene på drinker og bestemme laveste og høyeste fruktose innhold blant de drikker du vil teste. Husk at den første prøven (brus) kan være fortynnet eller på annen måte manipulert under forberedelse for analyse (avhengig av HPLC-metoden som blir benyttet) og slik at den analytt-konsentrasjonen i prøvene faktisk injisert på HPLC kan bli modifisert. Det er den analytt-konsentrasjonen i prøvene som kjøres på HPLC som må tas i betraktning.
• Bestem løsemiddel der du vil oppløse din analytt å gjøre opp kalibreringsstandarder. Dette løsningsmiddel må være i stand til på riktig måte å oppløse analytten over et forholdsvis bredt konsentrasjonsområde (i det minste så høyt som i prøvene man har til hensikt å teste). I tillegg bør dette oppløsningsmiddel ideelt sett være ganske lik den "mobile fase:" oppløsningsmidlet som brukes til å bære prøvene gjennom HPLC-instrument.
• beregne mengden av analytt som kreves for å lage et "lager standard" oppløsning av analytten. Dette er funnet ved å multiplisere den nødvendige konsentrasjon av lager standard av det ønskede volum. Konsentrasjonen av analytten i denne oppløsningen bør være minst 10% høyere enn den høyest forventede prøvekonsentrasjon. Hvis den høyeste forventede fruktosekonsentrasjonen i en leskedrikk prøven er 8 g / 100 ml, og deretter lager standard kan gjøres til en konsentrasjon på 10 gram fruktose / 100 ml. En rimelig volum er 500 ml, det vil si 8 / 100ml x 500 ml = 40 g fruktose ville være nødvendig.
• Vei ut den nødvendige mengden av analytt i et egnet nivå av presisjon. Ofte en vektverdi i gram presise til ett eller to desimaler er egnet, men større presisjon kan være nødvendig for enkelte metoder.
7. Overfør veide analytt i en volumetrisk kolbe på det nødvendige volumet og legge det ønskede løsningsmiddel til fyll merket på kolben. Bruk av en volumetrisk kolbe (heller enn en gradert begerglass, for eksempel), øker presisjonen av lager standard konsentrasjonsverdi. Sørg for at all analytten overføres til kolben; bruke noe av løsningsmiddelet å vaske den i, hvis det er nødvendig.
• Stopper i måleglasset og rist eller invertere til analytten er helt oppløst.
• Lag en serie med varierende fortynninger av lager standard ved å overføre kjente volumer av aksje standard i volumetriske kolber, ved hjelp av pipetter for nøyaktig overføring, deretter legge løsemiddel. Den laveste standardkonsentrasjon bør være under den laveste forventede prøven som skal analyseres. I brus eksempel, hvis den laveste forventede fruktosekonsentrasjonen i en prøve er 2 g / 100 ml, deretter en 1 gram / 100 ml standard kunne gjøres. Dette vil bli gjort av et tidobbelt fortynning av lager standard. Standardserien bør omfatte totalt fem eller seks konsentrasjoner, så flere fortynninger å produsere standarder for kanskje tre, fem og åtte gram fruktose / ml ville være nødvendig. Du har nå en serie av standardløsninger som å kalibrere HPLC.